Principais considerações de projeto para protocolos de estudo de validação de eliminação viral de produtos de terapia gênica

ICH Q5A(R2)-Fundação Internacional de Harmonização

O ICH Q5A(R2) foi oficialmente adotado em 1º de novembro de 2023 e representa o principal documento de orientação internacional para avaliação de segurança viral. Em comparação com o Q5A(R1) publicado em 1999, as atualizações significativas na versão R2 incluem: um capítulo recém-adicionado sobre avaliação da segurança viral na produção contínua (Capítulo 7); um papel reforçado da avaliação de riscos como base das estratégias de eliminação viral; incorporação do sequenciamento de próxima{10}geração (NGS) nas considerações de detecção viral; e requisitos explícitos para a avaliação de novos produtos e processos de fabricação. O Q5A(R2) foi adotado pelas autoridades reguladoras, incluindo FDA, EMA e PMDA, fornecendo uma estrutura técnica unificada para validação da eliminação viral em todo o mundo.

NMPA-sistema regulatório chinês

O quadro regulamentar da NMPA para a segurança viral abrange vários níveis:

Nível do documento	Nome do documento	Ano de emissão
Documento fundamental	Diretrizes Técnicas para Remoção/Inativação de Vírus de Produtos Sanguíneos	2002
Documento fundamental	Princípios gerais para revisão técnica de avaliação de segurança viral de tecidos biológicos-produtos derivados e produtos expressos de células eucarióticas-	2005
Diretriz-específica do produto	Diretrizes Técnicas para Pesquisa Farmacêutica e Avaliação de Aplicações de Ensaios Clínicos para Produtos de Terapia Gênica In Vivo baseados em Adeno{0}}Vírus Associado (rAAV)-	2023
Diretriz-específica do produto	Requisitos técnicos comuns para qualidade farmacêutica de produtos de terapia gênica in vivo baseados em vetores de adeno{0}}vírus associados (rAAV) recombinantes para solicitações de autorização de comercialização	2025
Diretriz inovadora	Diretrizes Técnicas para Validação de Plataforma de Processos de Eliminação Viral para Aplicações em Ensaios Clínicos de Produtos Proteicos Recombinantes Terapêuticos (Ensaio)a	2024

a: Esta diretriz representa a primeira vez que a autoridade reguladora chinesa estabeleceu requisitos técnicos sistemáticos para validação de plataforma de processos de eliminação viral e está alinhada com o espírito do ICH Q5A(R2).

FDA e EMA-Requisitos regulatórios dos EUA e da Europa

A FDA emitiu formalmente um documento de orientação da indústria baseado no ICH Q5A(R2) em janeiro de 2024. Além disso, o capítulo da Farmacopeia dos Estados Unidos (USP)<1050.1>fornece orientação técnica suplementar sobre o desenho, avaliação e caracterização de procedimentos de eliminação viral. A FDA organiza um Simpósio de Eliminação Viral a cada dois anos; o simpósio de 2023 abordou-tópicos de ponta, como novas modalidades, fabricação contínua, novos meios de cromatografia e filtros adsortivos. Os principais documentos de orientação da EMA incluem CPMP/BWP/268/95 (Nota de orientação sobre estudos de validação de vírus: o desenho, contribuição e interpretação de estudos que validam a inativação e remoção de vírus) e EMEA/CHMP/BWP/398498/2005 (Diretriz sobre avaliação de segurança de vírus de produtos medicinais de investigação biotecnológica), ambos harmonizados com o ICH Q5A(R2).

Identificação de fontes de contaminação viral

O ICH Q5A(R2) enfatiza que o desenho da validação da eliminação viral deve basear-se numa avaliação de risco abrangente. Para produtos de terapia genética, a identificação de fontes de contaminação viral deve abordar os seguintes níveis:

Nível do banco de células: vírus endógenos (por exemplo, partículas retrovirais) e vírus latentemente infecciosos potencialmente alojados nos substratos celulares de produção (por exemplo, HEK293, CHO, HeLa). Sabe-se que as células HEK293 contêm sequências Ad5 E1 endógenas e um fragmento de EBV de aproximadamente 900 pb e são capazes de expressar adenovírus{10}competentes para replicação; portanto, deve ser dada especial atenção a este risco na avaliação de riscos.

Nível de vírus auxiliar: a produção de vetores AAV normalmente emprega métodos como transfecção tripla usando plasmídeos auxiliares, que apresentam o risco de gerar adenovírus competente de replicação (RCA). Da mesma forma, células de empacotamento usadas na produção de vetores lentivirais podem gerar lentivírus competentes de replicação (RCL).

Nível de matérias-primas: Os vírus adventícios podem ser introduzidos através de matérias-primas utilizadas na fabricação, incluindo meios de cultura de células, rações e enzimas. Esse risco é particularmente significativo quando são usados ​​componentes-derivados de animais (por exemplo, soro fetal bovino, soluções digestivas de tripsina).

Diferenças de risco: terapia genética versus proteínas recombinantes tradicionais

Dimensão de Risco	Produtos Tradicionais de Proteína Recombinante	Produtos de terapia genética
Fonte viral	Vírus endógenos de banco de células; vírus adventícios	Vírus de banco de células; vírus auxiliares; vetores{0}competentes de replicação (RCV/RCL); integração do genoma hospedeiro
Substrato celular	CHO, NS0, Sp2/0 e outras linhas celulares bem{3}}caracterizadas	HEK293, HeLa, CHO, etc.; algumas linhagens celulares são de origem tumorigênica
Características do produto	Medicamento-à base de proteínas; estrutura bem-definida	Vetor viral; apresenta riscos de biossegurança
Estratégia de validação	Eliminação viral em-etapas múltiplas; ênfase na validação da etapa do processo	É necessária detecção de RCV/RCL; validação e testes essenciais
Validação de plataforma	Aplicável a processos estabelecidos como S/D, baixo pH, nanofiltração	Aplicabilidade limitada devido à diversidade de tipos de vetores

Tabela 1. Comparação de riscos de segurança viral: produtos de terapia genética versus produtos tradicionais de proteína recombinante

Princípios Gerais

A seleção de vírus indicadores é um elemento central na concepção de protocolos de validação de eliminação viral. O ICH Q5A(R2) exige que a seleção do vírus indicador seja baseada na avaliação de risco e leve em consideração os seguintes fatores:

Relevância do vírus para o substrato celular de produção (vírus relevante)

Propriedades físico-químicas do vírus (envelopado/não{0}}envelopado, DNA/RNA, faixa de tamanho)

Resistência do vírus a tratamentos físicos/químicos

Detectabilidade e biossegurança do vírus

Para produtos de terapia genética, a seleção de vírus indicadores deve considerar adicionalmente: o papel do próprio vírus vetor como um “vírus relevante”; o risco potencial de contaminação por vírus auxiliares; e os requisitos de detecção e validação para vírus{0}competentes de replicação (RCV/RCL).

Painel de vírus indicador recomendado

Vírus	Tipo	Envelope	Genoma	Tamanho (nm)	Justificativa de seleção/aplicação
MVM	Parvovírus	Nenhum	DNAss	18–26	Modelo-não envelopado; menor tamanho e maior resistência; adequado para validação de nanofiltração (geralmente não aplicável para produtos de vetor rAAV)
PPV	Parvovírus	Nenhum	DNAss	18–26	Modelo-não envelopado; vírus indicador comumente usado para produtos sanguíneos
Reo-3	Reovírus	Nenhum	dsRNA	60–80	Modelo-não envelopado; tamanho médio; alta estabilidade física
PRV	Herpesviridae	Sim	dsDNA	150–200	Modelo envelopado; tamanho grande; ampla gama de hosts
X-MuLV	Retrovírus	Sim	ssRNA	80–110	Modelo de retrovírus envelopado; apropriado para substratos celulares-derivados de CHO
BVDV	Flaviviridae	Sim	ssRNA	40–60	Modelo envelopado; usado para avaliar métodos de inativação química (substituto de HCV)
VSV	Rabdoviridae	Sim	ssRNA	70	Modelo envelopado; ampla tolerância ao pH; adequado para validação de inativação de-pH baixo

Tabela 2. Painel de vírus indicadores recomendados para validação de eliminação viral de produtos de terapia gênica

Considerações especiais para produtos vetoriais AAV

Para produtos de vetores de AAV recombinantes, as Diretrizes Técnicas da NMPA para Pesquisa Farmacêutica e Avaliação de Aplicações de Ensaios Clínicos para Produtos de Terapia Gênica In Vivo baseados em vetores de rAAV exigem atenção à detecção de AAV-competente de replicação (rcAAV). rcAAV refere-se a AAV capaz de replicação autônoma, que normalmente surge da recombinação homóloga entre o plasmídeo auxiliar e o genoma do produto AAV. A detecção de rcAAV é geralmente realizada utilizando ensaios infecciosos ou métodos qPCR, conduzidos separadamente na substância medicamentosa e no produto purificado.

Vale a pena notar que os processos de purificação a jusante para produtos de vetor AAV normalmente incluem digestão com nuclease, cromatografia (AEX), nanofiltração e cromatografia de troca iônica (CEX/IEX). Na validação tradicional da eliminação viral, estas etapas do processo podem resultar em perdas significativas do próprio vetor AAV; portanto, a interação entre o vetor e os vírus indicadores deve ser cuidadosamente considerada durante o projeto-de escala reduzida do modelo. Para certas etapas do processo (por exemplo, nanofiltração) onde as perdas do vetor AAV são substanciais, deve-se avaliar se os ajustes do processo são garantidos com base nos dados de validação (por exemplo, ajuste do tamanho dos poros da membrana de nanofiltração).

Princípios Gerais

O modelo-de escala reduzida (SDM) é a principal ferramenta para validação de liberação viral; seu design deve representar com precisão o desempenho da eliminação viral do processo de fabricação. O ICH Q5A(R2), Seção 6.2.2, exige explicitamente que o modelo de redução-mantenha consistência com o processo de fabricação nos principais parâmetros. Para produtos de terapia genética, as seguintes considerações são especialmente importantes no projeto de SDM:

Representatividade dos Parâmetros Críticos do Processo

O modelo-de redução de escala deve ser consistente com o processo de fabricação nos seguintes parâmetros: condições cromatográficas (composição do tampão, pH, condutividade); razão de carga (proporção de massa de proteína vetor/sobrenadante); tempo e temperatura de contato; vazão/tempo de residência; pureza e composição do produto. Para produtos AAV, o efeito da distribuição do tamanho das partículas vetoriais e do conteúdo do capsídeo vazio no desempenho da nanofiltração também deve ser abordado especificamente.

Requisitos de qualificação do modelo

O ICH Q5A(R2) exige qualificação adequada do modelo-de redução de escala, incluindo: comparação de atributos de qualidade do produto (por exemplo, pureza, recuperação, densidade); qualificação da consistência dos parâmetros críticos do processo; e garantir que o modelo-de redução de escala capture a variabilidade do processo de fabricação. Para as etapas de cromatografia, a consistência do perfil do pico, da eluição e da lavagem deve ser qualificada; para as etapas de nanofiltração, os efeitos da capacidade volumétrica e da composição do produto devem ser verificados.

Fórmula de cálculo do LRV

O valor de redução logarítmica (LRV) é a métrica principal para medir a eficácia da eliminação viral. O ICH Q5A(R2), Seção 6.5, fornece uma descrição detalhada dos métodos de cálculo do LRV e do tratamento estatístico. A fórmula básica de cálculo do LRV é: LRV=log₁₀(N₀/N), onde N₀ é o título inicial do vírus após o pico do vírus e N é o título residual do vírus após o tratamento do processo. Quando o título residual do vírus cai abaixo do limite de detecção do ensaio, métodos de estimativa como a distribuição de Poisson devem ser usados ​​(por exemplo, testes de grande-volume).

Aplicação de intervalos de confiança

Tanto o ICH Q5A(R2) quanto o EMA CPMP/BWP/268/95 exigem avaliação do intervalo de confiança dos resultados do cálculo do LRV. Normalmente é aplicado um intervalo de confiança de 95%.

Critérios de Eficácia

De acordo com as Diretrizes Técnicas da NMPA para Remoção/Inativação de Vírus de Produtos Sanguíneos, uma redução de vírus maior ou igual a 4 logs indica que a etapa do processo é eficaz para remoção/inativação de vírus. No entanto, este critério não é um limiar absoluto e deve ser avaliado de uma forma holística juntamente com as curvas de cinética de inativação, a fundamentação científica para a seleção do vírus indicador e a solidez geral da conceção do protocolo de validação. No caso dos produtos de terapia genética, deve ser dada especial atenção à capacidade de depuração cumulativa em todas as etapas do processo, para garantir que o perfil global de segurança viral se encontra num nível aceitável.

Aplicação e Desafios da Nanofiltração

A-filtração retentiva de vírus (nanofiltração) é uma etapa crítica de eliminação viral na purificação posterior de produtos de terapia genética. Os filtros retentivos-de vírus típicos têm um tamanho de poro de aproximadamente 20 nm. O mecanismo de eliminação viral da nanofiltração baseia-se principalmente na exclusão-com base no tamanho e pode remover com eficácia a maioria dos vírus maiores que o tamanho dos poros da membrana, incluindo pequenos parvovírus não{6}}envelopados, como MVM e PPV.

No entanto, a nanofiltração para produtos de terapia genética enfrenta desafios únicos: o tamanho dos vetores AAV (aproximadamente 20–26 nm) é semelhante ao de certos vírus indicadores (por exemplo, MVM, 18–26 nm), o que pode resultar na redução da recuperação do vetor; capsídeos vazios podem afetar o fluxo de filtração e a eficiência da retenção viral; a viscosidade da amostra pode aumentar significativamente com a concentração do vetor. Portanto, o projeto SDM para validação de nanofiltração deve levar em conta totalmente os efeitos da distribuição do tamanho das partículas do vetor e do conteúdo do capsídeo vazio no desempenho da filtração, e deve-se considerar o uso de membranas de nanofiltração com tamanhos de poros maiores, conforme apropriado.

Avaliação de eliminação viral de etapas de cromatografia

A cromatografia de troca iônica (IEX) é uma etapa central nos processos de purificação de produtos AAV, normalmente empregando digestão com nuclease seguida por cromatografia de troca aniônica (AEX) para capturar capsídeos vazios e defeituosos, ou cromatografia de troca catiônica (CEX) para purificação fina de capsídeos completos. Os mecanismos de eliminação viral nas etapas de cromatografia incluem exclusão de tamanho, interações eletrostáticas, interações de afinidade e outros fatores. As discussões no Simpósio de Eliminação Viral da FDA de 2023 destacaram que a eficácia da eliminação viral das etapas de cromatografia é influenciada por vários fatores, incluindo capacidade de carga, pH, condutividade e ciclagem de resina; uma abordagem de projeto ortogonal multifatorial deve ser adotada para uma avaliação abrangente.

Controle de segurança viral na fabricação contínua

O recém-adicionado Capítulo 7 do ICH Q5A(R2) estabelece requisitos específicos para avaliação de segurança viral na fabricação contínua. Para produtos de terapia genética, a fabricação contínua tornou-se uma importante direção de desenvolvimento, mas também introduz novos desafios de segurança viral. As estratégias de controle de segurança viral na fabricação contínua incluem:-filtros de barreira contra vírus em linha como medidas críticas de contenção; projeto apropriado de tempos de residência e fluxos de processo; incorporação de etapas de inativação com tempos de espera definidos; e aplicação aprimorada de tecnologia analítica de processo (PAT) para monitoramento-em tempo real de parâmetros críticos do processo.